Pharmaceutical Technology Brasil - Líquidos 2020

Pharmaceutical Technology 26 Edição Especial LÍQUIDOS 2020 nível de TOC. Além disso, o sistema possui uma lâmpada UV integrada que possui um efeito oxidante e bactericida nos com- primentos de onda de 185 nm e 254 nm, respectivamente. Além disso, o sistema de água ultrapura arium® pro VF possui um módulo de ultrafiltro interno usado como filtro de fluxo cruzado. A membrana do ultrafiltro incorporada neste filtro retém colóides, microorganismos, endotoxinas, RNA e DNA. Um filtro final de 0,2 μm instalado na saída da água serve para remover partículas e bactérias durante a distribuição da água ultrapura produzida. O processo que a unidade emprega para purificar a água é mostrado na Figura 3 (diagrama de fluxo do arium® pro VF). Materiais e método As amostras foram analisadas usando um sistema HPLC Agilent 1200 Series (Figura 4 e Tabela 1) com uma coluna Rezex RNM Carbohydrate Na + 8% HPLC fornecida pela Phenomenex [6]. Esta coluna é preenchida com um co- polímero de poliestireno-divinilbenzeno reticulado modificado por grupos sulfo- nato de sódio e utiliza um mecanismo de exclusão de íons. Isso significa que os analitos são sepa- rados com base em diferentes interações iônicas. Devido aos grupos sulfonato na superfície deste material de embalagem da coluna, os poros têm uma carga negativa. Como resultado, moléculas carregadas negativamente não podem penetrar nos poros do material, o que faz com que elas eluam mais cedo. Esse mecanismo de exclusão de íons é baseado no equilíbrio de Gibbs-Donnan, que governa o comportamento dos íons próximos a uma membrana. Os analitos que são capazes de penetrar nos poros da membrana são subsequente- mente separados com base nas diferenças estéricas, bem como nas interações hidro- fóbicas e polares com os grupos funcionais na superfície da fase estacionária. Para mais detalhes sobre esse mecanismo de separação, consulte [7]. Os tempos de retenção para vários tipos de açúcares são determinados pela absorbância do sinal do Indice de Refração (IR, RI em Inglês). Este sinal RI é expresso como um número adimensional em nano unidades de índice de refração (nRIU) e in- dica a diferença entre o índice de refração da amostra na célula de amostra e a fase móvel na célula de referência. A água ultrapura produzida pelo sis- tema arium® pro VF foi usada como fase móvel. Para desgaseificar o eluente no sistema HPLC, essa água ultrapura foi filtrada a vácuo através de uma unidade descartável Sartolab BT 500 Bottle Top equipada com uma membrana de 0,2 μm (Sartorius Sartolab BT 180C5). Procedimento para análise por HPLC Para preparar as execuções analíticas, a coluna Rezex foi aquecida a 75 ° C no compartimento da coluna (aquecedor) e lavada durante a noite com água ultrapura arium® pro VF a 0,6 ml / min. A unidade óptica do detector RI foi aquecida a 35°C. As amostras a serem analisadas foram preparadas com água ultrapura arium® pro VF e pré-filtradas por uma unidade de filtro de seringa de 0,2 μm (Sartorius Minisart® RC4, nº 17822). As amostras foram analisadas por HPLC de acordo com os parâmetros definidos pelo método de HPLC [6] (Tabela 2). Resultados Para determinar os tempos de retenção dos tipos individuais de açúcar (Tabela 3), estes foram preparados e injetados indi- vidualmente (Figura 5). Como açúcares diferentes interagem com a fase estacio- nária em um grau variável, os tempos de retenção específicos são registrados pelo detector RI quando cada açúcar se move pela coluna. Após a determinação dos tipos indivi- duais de açúcar, uma mistura de açúcar foi preparada e separada (Figura 5). Os componentes individuais do açúcar foram separados um do outro. Os picos para os diferentes tempos de retenção podem ser atribuídos às amostras de açúcar individuais ensaiadas. O efeito de contaminantes, ou a influência de sais, foi simulado pela injeção de tampão fosfato de potássio e água da torneira (Figura 6). A injeção de água da torneira com uma condutividade de 265 μS / cm e de tampão de fosfato de potássio com uma conduti- vidade de 1.700 μS / cm mostrou sinais claros e, portanto, pode ser claramente identificada como contaminação. Os íons com carga múltipla são espe- cialmente propensos à ligação com grupos sulfonato. Isso altera o equilíbrio da disso- ciação e pode afetar o tempo de retenção de um açúcar específico. Por esse motivo, a fase móvel deve estar livre de sais e outros contaminantes para realizar uma análise HPLC confiável com tempos de retenção estáveis e evitar picos fantasmas. A água ultrapura arium® usada nesta análise tem uma condutividade de 0,055 FIGURA 4 Sistema HPLC Agilent série 1200 (foto cortesia de Sartorius) TABELA 1 Equipamento Fabricante Código Bomba binária Agilent G1312A Desgaseificador Agilent G1379B Amostrador automático ALS Agilent G1316A Compartimento de coluna termostatizado (TCC) Agilent G1316A Detector de índice de refração, RID Agilent G1362A Coluna Phenomenex 00H-0136-KO Rezex RNM Carbohydrate Na+ 8% Equipamentos e materiais TABELA 2 Taxa de fluxo [ml/min] 0.6 Tempo [min] 25 Pressão máxima [bar] 70 Temperatura no compartimento da coluna [°C] 75 Temperatura do detector RI [°C] 35 Volume de injeção [μl] 2 Método HPLC TABELA 3 Açúcar Tempo de retenção[min] Rafinose Fluka 83400 8.96 Maltose SIGMA M5885 10.30 Glucose ROTH 6887.0 12.53 Frutose SIGMA F0127 13.62 Tempos de retenção para amostras de açúcar passadas por uma coluna Rezex RNM Carbohydrate Na + 8%